蛋白质可能已被蛋白酶降解。

在样品和缓冲液中加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解消化。将样品通过苯甲脒琼脂糖凝胶 4 Fast Flow等介质运行，以去除胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。

在样品制备过程中过滤蛋白质吸附。

使用不同膜类型的过滤器。再生纤维素、PVDF 和 PES 通常表现出低蛋白质结合，是确定最适合您应用的膜类型的良好起点。

样品沉淀。

可能是由于去除盐分或不合适的缓冲条件造成的。

疏水性蛋白质。蛋白质仍然附着在配体上。

使用离液剂、极性降低剂或清洁剂。

起始材料中不存在组氨酸标签蛋白。

验证起始材料中组氨酸标签蛋白的存在，例如，通过蛋白质印迹。

洗脱条件太温和（组氨酸标签蛋白仍然结合）。

随着咪唑浓度的增加或 pH 值的降低而洗脱。

蛋白质在柱中沉淀。

通过使用线性咪唑梯度而不是咪唑步骤进行洗脱来减少样品量或降低蛋白质浓度。尝试清洁剂或改变 NaCl 浓度。

发生非特异性疏水或其他相互作用。

在洗脱缓冲液中加入非离子去污剂（如 0.2% Triton X-100）或改变 NaCl 浓度。

组氨酸标签蛋白未完全洗脱。

用更大体积的洗脱缓冲液洗脱或增加咪唑的浓度。

镍离子正从基质中剥离出来。

如果样品导致剥离，例如，如果组氨酸标记的蛋白质分泌到真核细胞培养物上清液中，则改用 Ni Sepharose excel。

洗脱量不足。

增加使用的洗脱缓冲液的体积。在某些情况下，特别是在标记蛋白质的柱上裂解后，可能需要更大体积的缓冲液来洗脱标记蛋白质。

洗脱时间不足。

通过降低洗脱过程中的流速来增加用于洗脱的时间。对于 GSTrap 色谱柱，为获得最佳结果，在样品应用过程中使用 0.2 至 1 毫升/分钟（1 毫升 HiTrap 柱）和 0.5 至 5 毫升/分钟（5 毫升 HiTrap 柱）的流速。对于离心方法，在洗脱过程中降低离心速度。

谷胱甘肽浓度不足。

增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度：对于大多数应用，本协议中推荐的 10 mM 应该足够了，但也存在例外情况。尝试使用 50 mM Tris-HCl、20 至 40 mM 还原型谷胱甘肽、pH 8.0 作为洗脱缓冲液。

洗脱缓冲液的 pH 值太低。

提高洗脱缓冲液的 pH 值。将洗脱缓冲液的 pH 值提高到 8 到 9 可以改善洗脱，而无需增加用于洗脱的谷胱甘肽浓度。

洗脱缓冲液的离子强度太低。

增加洗脱缓冲液的离子强度。在洗脱缓冲液中加入 0.1 到 0.2 M NaCl 也可以改善结果。

洗脱缓冲液中的谷胱甘肽被氧化。

使用新鲜的洗脱缓冲液。添加 DTT。

非特异性疏水相互作用导致与介质或蛋白质聚集的非特异性相互作用，从而防止标记蛋白质的溶解和洗脱。

在洗脱缓冲液中加入非离子去污剂。添加 0.1% Triton X-100 或 2% 正辛基葡萄糖苷可以显着改善一些 GST 标签蛋白的洗脱。

粗提取物中的因素会干扰结合。

在生长培养基中加入葡萄糖以抑制淀粉酶的表达。

MBP 标签不存在。

使用蛋白酶缺陷型大肠杆菌表达菌株。在细胞裂解过程中加入蛋白酶抑制剂。

MBP 标签不可访问。

将 MBP 标签融合到其他蛋白质末端。使用另一个链接器。

由于蛋白质浓度高，蛋白质在柱中沉淀。

根据说明清洁色谱柱。在接下来的运行中，减少样品量，或通过线性梯度洗脱而不是逐步洗脱来降低蛋白质浓度。尝试使用清洁剂或更改 NaCl 浓度。如果使用了 MBPTrap HP 1 ml 色谱柱，请更换为更大的 MBPTrap HP 5 ml。如果应用相同数量的样品，这将降低最终浓度。为了快速放大，通过将一根色谱柱的末端拧入下一根色谱柱的顶部，将两根或更多根色谱柱串联起来。但是请注意，串联连接柱会增加背压。