细胞基因敲除的方法有gRNA质粒模式，慢病毒模式，RNP模式。RNP模式核心在于将双cas9蛋白与sgRNA形成RNP（核糖核蛋白）体系，二者在体外组装形成RNP复合物，通过电转染方式将其转入待编辑细胞，通过同源定向修复或者非同源末端重组实现基因敲除。慢病毒模式，是一种将CRISPR/Cas9基因编辑系统通过慢病毒载体传递至宿主细胞内，以实现基因敲除的技术。慢病毒载体因其稳定的基因整合特性和广泛的细胞转染能力，成为一种理想的基因传递工具，可显著提升对目标细胞的基因编辑效率。

条件性基因敲除技术用于研究可能致命的基因。Cre-LoxP系统是常用的敲除技术。在条件性敲除中，目标基因两侧会被插入LoxP位点，形成“floxed”基因。在没有Cre酶的情况下，基因保持活性。当引入Cre酶时，Cre酶会识别LoxP位点并切除它们之间的基因序列，从而敲除基因。

卡梅德科技可根据客户需求设计小片段敲除、大片段敲除、移码突变等基因敲除细胞方案。小片段敲除将gRNA设在外显子两端的内含子中；移码敲除将gRNA设在外显子上；大片段敲除将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

hepa1-6细胞系T7EI检测结果

1.如何进行基因敲除细胞单克隆的挑选？

答：可通过有限稀释法将单细胞铺在96孔板中，培养一段时间后显微镜下观察单克隆形成情况，待单细胞扩增到一定数量再进行单克隆挑选和鉴定。

2.构建基因敲除细胞系的难点是什么？

答：包括递送方式、培养、转染和单克隆制备困难。递送方式建议选择RNP，效率高且低脱靶，摸索细胞培养条件，优化转染方法和单克隆，确保敲除实验前获取最优条件。

3. 使用CRISPR-Cas9体系时，如何确定细胞的转染效率？

答：荧光蛋白报告基因：通过转染EGFP mRNA或其他荧光蛋白mRNA来确定细胞的转染效率。