基因敲入（Knock in Ki），是指将特定的基因或DNA序列精确地插入到基因组中，主要通过同源重组和CRISPR/Cas9系统实现。同源重组介导法需构建含有同源重组臂的DNA修复模板；CRISPR/Cas9系统，首先，cas9酶切割靶序列产生DSB；其次，引入高度同源的DNA修复模板，细胞启动HDR或NHEJ修复机制，提供外源donor DNA模板，可将外源基因精准敲入。
卡梅德（KMD Bioscience）科技凭借在基因工程领域的多年经验，搭建了基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑平台，可为客户提供植物基因敲入载体构建及遗传转化服务，涵盖sgRNA设计、敲入载体构建、遗传转化、筛选和验证等实验环节，此外还具备植物蛋白表达、蛋白互作等一系列下游实验。
基于CRISPR/Cas9系统的基因敲入涉及donor DNA构建。donor DNA含目的基因序列和与目标位点两侧有一定长度的同源臂，因此donor DNA的构建对于基因插入具有重要的意义。小片段插入时，选择单链DNA供体分子。大片段插入时，选择含3'同源臂的双链DNA供体。基于CRISPR-Cas系统的基因编辑载体，其植物转化方法常用农杆菌介导转化法，单子叶植物采用基因枪法。此外，GFP表达盒有助于基因表达的监测和蛋白质定位的研究，还能加速转基因植物的筛选和鉴定过程。
图1.基于CRISPR-Cas9系统基因敲入
1.donor DNA的设计
答：donor DNA指的是携带目的基因片段的DNA分子，被用于整合到靶位点的基因组中，其可以是单链DNA或双链DNA分子。
2.同源臂的作用是什么？
答：同源臂是donor DNA与受体DNA之间发生同源重组的区域。在设计donor DNA时，需要在目的基因片段的两侧添加与受体DNA序列互补的同源臂。同源臂的长度一般在50-2000bp之间，具体取决于插入片段的大小和基因编辑技术的要求。
3.donor DNA导入方法
答：脂质体介导转染，通过脂质体包裹donor DNA和CRISPR-Cas9复合物，随后转染到目标细胞中；病毒载体介导的转染，感染效率高，可以用于体内和体外实验。
销售微信
官方公众号
0
