基因敲除（Knockout, KO）技术，是一种能够使生物体基因组中的特定基因丧失功能的方法。该技术通过在目标基因的DNA序列上引入突变，阻止其编码正常的蛋白质，从而导致基因功能的丧失。在植物遗传学和作物改良领域，通过敲除特定基因，观察植物表型的变化，进而研究基因的功能。
基因敲除方法，包括同源重组法和CRISPR/Cas9系统。同源重组法，是通过设计特定的同源臂替换掉目标基因片段，从而实现基因敲除。CRISPR Cas9系统，首先是Cas9酶切割诱导DNA双链断裂，其次细胞启动NHEJ或HDR修复机制，发生碱基插入或缺失而导致基因敲除。此外，RNAi干扰技术，通过沉默或降解靶基因的mRNA，阻止蛋白的转录和翻译，也可以以实现基因表达降低或敲除。
卡梅德（KMD Bioscience）科技凭借在基因编辑领域的丰富经验，搭建了先进的基因编辑平台，为植物基因敲除提供了高效和精确的服务。该平台运用前沿的CRISPR/Cas9技术，结合高通量测序验证手段，为客户提供一对一基因敲除方案设计、敲除载体构建、遗传转化、基因敲除效率检测等实验环节服务。
图1.基因敲除方法
卡梅德（KMD Bioscience）科技可实现单基因敲除、多基因敲除、片段敲除以及移码突变多种敲除模式。服务内容涵盖了模式植物、豆科植物、葫芦科植物、锦葵科植物、茄科植物。同时，还可根据客户的需要，一对一设计敲除方案。
RNAi技术由于具有高特异性和高效性、费用低的特点，而在植物基因敲除研究中被广泛应用。嵌套式siRNA能够有效沉默特定基因，卡梅德可提供单个和多个嵌套式的siRNA设计，以有效沉默特定基因的表达。
若需基因彻底失活，可选择CRISPR/Cas9技术，其载体构建过程简单，编辑效率高，已在烟草、高粱、水稻、拟南芥等植物中都取得了成功。卡梅德科技可为提供多种Cas9蛋白突变体，如SpCas9、SaCas9、SpEQR-Cas9、SpVRER-Cas9等，为您设计高特异性的sgRNA，以确保基因敲除效率。
表1.RNAi干扰技术服务
步骤 | 服务内容 | 周期 |
Step1 目的片段克隆 | （1）以基因组DNA为模板，用带酶切位点的引物进行PCR扩增； |
1周 |
Step2 siRNA设计
| （1）在线工具或软件设计特异性siRNA； | 2-3月 |
Step3 载体构建
| （1）siRNA序列与表达载体用同源重组法连接； | 咨询 |
Step4 质粒转化
| （1）重组质粒转化至感受态细胞；取单克隆菌株，PCR检测、电泳验证； （2）验证成功的重组质粒转入植物受体； | 咨询 |
Step5 表型和基因功能分析
| （1）筛选培养基筛选抗性芽，通过PCR和GUS组织染色验证抗性； | 1周 |
基因敲除方案：
图2.单靶点基因敲除
图3.多靶点基因敲除
--由专业技术团队负责设计高特异性的sgRNA，精确导向Cas9蛋白至靶位点。
--具备一系列的下游实验服务。包括WB、SDS-PAGE、基因敲除效率检测等服务。
--项目可追踪：定期汇报机制将保证您远程了解实验进展，项目透明化。
1. 什么是基因敲除？
答：基因敲除技术是一种遗传工程基因修饰方法，其主要针对特定序列已知而功能尚未明确的基因。通过实施特定的基因改造程序，实现基因功能的丧失，从而推断该基因的生物学功能。
2. 基因敲除技术的关键是什么
答：包括精确设计以识别靶点的sgRNA序列，以及构建有效的表达系统，以传递sgRNA序列和Cas9酶至目标细胞，并确保其在适当的时间和位置发挥功能。
3. 怎么鉴定基因敲除成功？
答：DNA水平（PCR扩增与测序）、RNA水平（RT-qPCR）、蛋白质水平（WB、ELISA）、功能验证。
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