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微生物基因敲入服务
微生物基因敲入服务介绍

细菌基因组相对简单,易于遗传操作,可通过转化、转导和接合等方式进行基因转移。常被用作基因编辑的载体,利用CRISPR-Cas等技术,通过细菌的免疫系统来编辑其基因组,实现对外源DNA序列的精确删除、替换或插入。

酿酒酵母,具有基因组结构相对紧凑、间隔区较短、内含子数量有限、培养容易,生长周期短、繁殖快,便于筛选和鉴定、具备真核细胞基本特征等特点,是研究真核生物基因功能和基因编辑技术的理想模型。

卡梅德(KMD Bioscience)科技凭借在基因工程领域的多年经验,搭建了基于CRISPR/Cas9系统和Red重组系统的基因编辑平台,可为客户提供sgRNA设计与合成、sgRNA-Cas9载体构建、同源臂构建、质粒共转染、筛选和验证等实验环节。此外还具备一系列下游服务,包括稳定细胞株开发、蛋白表达、蛋白纯化、蛋白修饰等实验。

微生物

常见的菌株

细菌

大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、沙门氏菌、鲍曼不动杆菌、伯克霍尔德氏菌、芽孢杆菌系列、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒状杆菌、乳酸菌系列、变形链球菌、粪链球菌、肺链球菌、猪链球菌、红球菌等其他细菌;

真菌

酿酒酵母、毕赤酵母、白色念珠菌、马尔尼菲篮状菌、阿萨希毛孢子菌等、曲霉系列、植物炭疽菌系列、灰葡萄孢霉等、香菇、双孢蘑菇、金针菇等其他真菌;

备注:若有其他菌株的基因编辑需求,可与我们联系提供一对一定制服务。


内容

定点敲入,是将外源功能基因转入细胞,并与基因组中的同源序列进行同源重组,而将外源基因插入到基因组中的技术。通常利用CRISPR/Cas9工具,需要设计特定的sgRNA和donor DNA。

定点整合,指构建含有同源序列的DNA片段的整合载体,通过转化使外源DNA序列与靶序列之间发生同源重组,从而将靶DNA序列定点破坏,通过一系列筛选手段,得到基因插入菌株的过程。

步骤

服务内容

周期

Step1 序列分析及引物设计

(1)客户提供基因序列;

(2)生信分析,制定敲入方案;

(3)引物设计;

(4)菌株抗性验证;

1周

Step2 整合载体构建(定点整合)

(1)同源臂片段扩增;

(2)同源臂连接中间载体;

(3)目的基因-同源臂中间载体构建;

(4)目的片段扩增;

(5)目的基因连接带有同源臂的中间载体;

(6)将目的基因酶切片段与敲入载体连接;

(7)菌落PCR验证;

2-3月

Step3 敲入菌株筛选

(1)感受态细胞制备;

(2)电转化:含目的基因片段的敲入载体转化感受态细胞;

(3)双交换筛选:筛选成功整合外源片段的阳性克隆;

咨询

(4)Step4 菌株验证

(1)菌落PCR鉴定;

咨询

备注:我们也提供基于CRISPR Cas9系统的定点敲入服务,可与我们联系制定敲入方案。


流程

CRISPR cas9定点敲入实验流程-卡梅德科技.jpg

优势

微生物基因敲入服务-卡梅德科技.png

常见问题解答

1.微生物基因敲入有哪些类型?

答:原位敲入和定点敲入。原位敲入,在原基因敲除的位点插入新基因,是基因敲除的逆过程。在基因定点敲入技术中,无论目标基因的位点位于何处,通过特定启动子控制的转移载体实现基因的转座,确保了插入位点的精确性。

2.sgRNA的设计注意事项?

答:sgRNA的设计影响基因敲入效率,需要考虑候选编辑位点的序列、位置、正负链、GC含量及潜在的脱靶位点等信息。

3.如何提高微生物基因敲入的效率?

答:选择高活性的Cas9蛋白变体和设计高效的gRNA,优化同源臂设计及培养条件来提高基因敲入的效率和准确性。

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