当前，基于CRISPR Cas9技术定点整合，主要用于将动物细胞中的目的基因修饰并替换为人的基因，进而构建动物（CDX）模型等。

实现KI的策略包括：采用合成的寡核苷酸（Oligo）或单链DNA（ssDNA）作为供体（Donor）以实现长片段的整合；通过腺相关病毒（AAV）介导的方式，利用其以单链形式存在于细胞核中的特性，将ssDNA作为供体载体导入；以及利用双链DNA片段或环状质粒作为供体来达成KI的目标。

图1.细胞基因敲入服务流程图

图2.基因敲入细胞方案

1.什么是细胞基因敲入技术？

答：细胞基因敲入是一种将特定的外源基因片段精准地插入到细胞基因组中的技术。实现细胞基因敲入通常借助先进的基因编辑工具，如CRISPR/Cas9系统与同源重组修复机制相结合。通过设计针对目标插入位点的向导RNA（gRNA），引导Cas9核酸酶在细胞基因组的特定位置产生双链断裂，然后提供含有目的基因片段以及与目标插入位点两侧序列同源的修复模板，细胞通过同源重组修复机制，将目的基因片段准确地插入到目标位置。

2.细胞基因敲入技术的优势有哪些？

答：一方面，可以精准地在特定位置插入目的基因，实现对细胞基因组的精准修饰，这有助于研究特定基因的功能、表达调控以及蛋白质相互作用等。另一方面，通过敲入具有特定功能的基因片段，如报告基因、标签基因或治疗性基因等，可以为细胞生物学研究、疾病模型构建和基因治疗提供有力工具。

3.细胞基因敲入服务的流程是怎样的？

答：细胞检测、敲除载体构建和Donor载体构建、细胞转染（将gRNA、Cas9和Donor导入细胞）、基因突变Cell pool构建、单克隆筛选和鉴定以及稳定敲入细胞株的培养和验证。