微生物是一类体积微小、结构简单、肉眼不可见或不易看见的生物群体，它们在自然界中无处不在，包括细菌、真菌、原生动物、藻类、病毒等。通过基因工程对微生物基因组进行定点修饰，可达到改良菌种或研究基因功能的目的。
微生物基因敲除可通过λ-Red同源重组法以及CRISPR/Cas9系统实现。λ-Red同源重组法，利用λ噬菌体的Red重组酶系统来促进同源重组的发生，只需要40-60 bp的同源序列即可实现高效的同源重组。相比于传统λ-Red重组系统，CRISPR-Cas9工具具有简便、高效、无需筛选标记、阳性克隆鉴定等优点。
卡梅德（KMD Bioscience）科技凭借在基因工程领域的多年经验，以及搭建的基因编辑平台，可为客户提供微生物基因改造方案设计、菌株构建等服务，包括大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌系列等细菌、以及酿酒酵母、毕赤酵母、白色念珠菌等微生物。此外，还提供蛋白表达与纯化等系列下游实验服务。
当细胞内产生DSBs双链片段时，细胞启动同源末端定向修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）两种机制进行修复，真核生物主要依赖于HDR（需提供同源DNA片段）和NHEJ（不需提供同源片段）两种修复途径，而原核生物主要依赖于HDR进行修复。NHEJ途径只存在于少数细菌中，多数细菌依赖于HDR途径完成修复。基于CRISPR-Cas9的基因编辑在原核生物中被广泛使用，引入外源DNA片段时可实现基因的插入、缺失、突变。大肠杆菌因其遗传背景清楚、技术操作简单、培养条件简单等优点，而作为基因编辑研究中常用的模式生物。毕赤酵母具有生长速度快、高密度发酵、易于遗传改造等优点，适用于生产需要修饰以及在原核系统中难以表达的蛋白。
| 微生物 | 常见的菌株 |
细菌 | 大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、沙门氏菌、鲍曼不动杆菌、伯克霍尔德氏菌、芽孢杆菌系列、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒状杆菌、乳酸菌系列、变形链球菌、粪链球菌、肺链球菌、猪链球菌、红球菌等其他细菌； |
真菌 | 酿酒酵母、毕赤酵母、白色念珠菌、马尔尼菲篮状菌、阿萨希毛孢子菌等、曲霉系列、植物炭疽菌系列、灰葡萄孢霉等、香菇、双孢蘑菇、金针菇等其他真菌； |
备注：若有其他菌株的基因编辑需求，可与我们联系提供一对一定制服务。 | |
表1.微生物基因编辑种类
基于CRISPR/Cas9技术的微生物基因敲除体系的建立，包括sgRNA设计、载体构建及转化、转化子筛选和分子鉴定等步骤。
λ-Red同源重组法，需设计同源臂序列并构建敲除载体；将同源臂序列及载体转染宿主菌；在Red重组酶的作用下，敲除载体与目标基因发生同源重组反应，导致目标基因被抗性基因所替代。最终，通过抗性基因的选择性富集，实现对敲除菌株的筛选。
步骤 | 服务内容 | 周期 |
Step1 sgRNA设计 | （1）客户提供目标基因； （2）生信分析，确定靶标位点，根据PAM位点设计打靶序列，其末端加上酶切位点； （3）合成sgRNA序列； | 1周 |
Step2 CRISPR Cas9相关载体构建 | （1）sgRNA载体构建并转化至大肠杆菌； （2）donorDNA片段：同源重组法构建靶基因上、下游DNA片段并连接； | 2-3月 |
Step3 载体转化 | （1）含sgRNA表达盒的质粒（如pCfB2312）转化至宿主菌中； （2）将sgRNA载体和同donor DNA转化进稳定表达Cas9蛋白的宿主菌； | 咨询 |
Step4菌株验证 | （1）抗性筛选：G418或Nat抗生素筛选； （2）取单克隆菌株，PCR检测、电泳验证； | 咨询 |
1.细菌基因敲除有哪些方法？
答：基于Red的同源重组法和CRISPR/Cas9技术。Red酶介导的基因敲除，需要消除菌株的抗性基因。而CRISPR/Cas9方法则能实现无痕敲除，即不残留抗性或重组位点，同时消除外源质粒。
2.细菌基因敲除有哪些应用？
答：品种改良、疾病机理研究、免疫应用、精准医疗（遗传病的靶向治疗）、抗生素的研发、工业用酶的发现及微生物发酵行业等。
3.细菌基因敲除实验流程？
答：构建CRISPR/Cas系列载体、转化感受态宿主菌、筛选和验证基因敲除菌株、菌株保存。
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