1.单克隆抗体的基本概念

抗体（antibody, Ab）是由效应B细胞（效应淋巴B细胞）分泌，机体用于抵御外来物质，如病毒，细菌等抗原，结构呈“Y”字型的球状蛋白质，仅仅存在于脊椎动物的血液和B淋巴细胞膜表面。顾名思义，单克隆抗体是指由同一个B细胞分裂产生的子代B细胞所分泌产生的免疫球蛋白，这些免疫球蛋白具有高度均一性：识别同一种抗原表位。单克隆抗体的制备工作常采用杂交瘤技术，如小鼠单克隆抗体的制备利用骨髓瘤细胞的永生特性让B细胞体外永生持续产生抗体，这两种细胞的融合细胞即为抗体杂交瘤。

2. 杂交瘤单抗制备原理 

杂交瘤的制备涉及到两种细胞的获得与培养：骨髓瘤细胞和能分泌抗体的细胞。通常使用的能分泌抗体的细胞为B淋巴细胞，但在某些条件下也可以使用其他类型的细胞，如外周血单核细胞。B淋巴细胞不能适应体外培养条件下生产，因此需要其进行永生化处理，而骨髓瘤细胞则能体外永生培养，因此这两者融合之后，形成融合细胞既保留了效应B细胞分泌抗体的能力，又保持了瘤细胞体外无限繁殖的特征。制备小鼠杂交瘤所采用的骨髓瘤细胞有SP2/0和NS0细胞，其他物种的杂交瘤制备几乎采用的是前两者与脾细胞的异源融合。其制备原理示意如下：

3.单克隆抗体制备的基本流程

3.1抗原准备 

抗原类型多种多样，可以是小分子多肽，化合物，蛋白等。按照免疫学理论，当抗原分子量小于5kDa时，抗原的免疫原性不足以刺激机体产生免疫反应，即获得能分泌抗原特异性的脾细胞或其他淋巴细胞。这些抗原也称为半抗原，在进行动物免疫之前需要进行改造，如载体偶联（BSA，KLH等），变成完全抗原。

3.2动物免疫 

一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照每只小鼠50-100ug/0.5ml的剂量进行肌肉注射免疫，免疫次数为4-6次，每次免疫之前采血清，ELISA检测血清抗体效价。

3.3细胞融合 

当小鼠血清效价达到预期值时~104ELISA效价时，采血、处死，消毒，取脾脏，剪碎脾脏后，滤网碾压制备单细胞悬液。 取预先复苏的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，通过PEG或电融合促进淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。 

3.4选择性培养 

选择性培养是指利用杂交瘤细胞的特性，正确融合的骨髓瘤细胞能够编码次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶在HAT选择性培养基中能存活，而骨髓瘤-骨髓瘤细胞、B细胞-B细胞融合细胞则再选择培养条件下不能存活。

3.5杂交瘤细胞克隆与亚克隆

经过HAT选择性培养基筛选之后的杂交瘤细胞，会聚集成团，通过有限稀释法将成团细胞分散后，转入96孔板进行克隆培养，通过ELISA鉴定细胞培养上清的抗体效价，特异性，亲和力，识别抗原表位，选择阳性克隆后再重复之前的操作进行亚克隆，最终获得由单一B细胞来源的杂交瘤细胞珠。这步是整个杂交瘤制备的关键之处，筛选策略和筛选方法对最终理想的单克隆抗体杂交里起着至关重要的作用。

3.6规模化制备单抗 

规模化制备单克隆抗体主要采用动物腹水生产和体外培养法：

3.6.1腹水生产法 ：取同系Balb/c小鼠，腹腔经过液体石腊或降植烷预处理1-2周后，腹腔接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。

3.6.2体外培养法 ：体外培养法通常是指用细胞工厂大规模培养杂交瘤细胞，取培养的细胞上清进行抗体纯化，优点是可以获得无动物源的单克隆抗体，缺点是细胞培养上清抗体含量较低，需要大规模制备，浓缩上清。

4. 单克隆抗体制备的应用

①、医学诊断和治疗：单克隆抗体在医学诊断中用于检测特定蛋白质、病原体或其他生物分子。在治疗方面，它们被用于治疗癌症、自身免疫性疾病、传染病等。例如，癌症治疗中的一些单克隆抗体被设计用于靶向肿瘤细胞，如曲妥珠单抗（Rituximab）用于治疗非霍奇金淋巴瘤。

②、生物学研究：单克隆抗体被用作实验室研究中的工具，用于检测特定蛋白质在生物系统中的表达、定位和功能。它们可用于免疫印迹、流式细胞术、免疫组化等实验技术。

③、药物研发：在药物开发过程中，单克隆抗体可以作为候选药物的生物学靶点。它们也被用作药物的载体，例如，将药物连接到单克隆抗体上，以实现特定细胞的靶向输送。

④、诊断试剂：单克隆抗体被广泛应用于医学诊断试剂的制备，如ELISA（酶联免疫吸附试验）、免疫层析等。它们可以检测血清中的生物标志物，帮助诊断疾病。

⑤、免疫治疗：一些单克隆抗体被设计用于增强免疫系统的功能，例如，通过激活T细胞或抑制免疫检查点来增强抗肿瘤免疫应答。

⑥、疫苗生产：单克隆抗体可以被用作疫苗生产中的原料，例如，用于病毒疫苗的质控。