嵌合抗体是人们最早成功研究并成功制备的基因工程抗体。它是通过DNA重组技术将鼠源性单克隆抗体的可变区基因与人抗体的恒定区基因拼接为重组基因，然后克隆至合适的表达载体，转染合适细胞系来表达嵌合抗体。通过嵌合抗体技术，可以有效地减少鼠源性成分的含量，并且保持其高特异性和亲和力，从而使得基因工程抗体的多样性大大增强，从而大大缩短了操作和R&D的周期。越来越多的科学家从嵌合抗体出发，在人鼠嵌合抗体的基础上进一步做抗体人源化、抗体亲和力成熟等，以期获得免疫原性低、亲和力高、特异性强的药物靶点抗体，嵌合抗体的体外重组表达则成为药物靶点抗体开发中较为重要的一部分。

图1：嵌合抗体基本结构示意图

1.嵌合抗体的表达

具有生物活性的基因工程抗体在不同的表达系统中，不仅表达产量明显不同，表达产物的活性也存在明显差异，因此选择合适的表达系统对于基因工程抗体至关重要。表1. 1总结不同表达系统的特点。哺乳动物细胞表达系统可以在蛋白表达过程中正确的折叠与聚合，具有翻译后修饰等功能。比起真核表达系统，哺乳动物细胞表现的蛋白质具有极强的生物学特异性，其表现的蛋白质具有较强的稳定性和耐药性，这使得它们成为卡梅德重组嵌合抗体表现的理想材料。

表1.1-不同表达系统对比

2.重组嵌合抗体设计

重组嵌合抗体属于基因工程抗体，其过程为将编码抗体的基因通过基因重组技术以及蛋白质工程技术进行人工改造，通过转染到对应的受体细胞最终获得表达的抗体分子。通过将鼠源性抗体的V 基因（Fab）和人抗体的C 基因（Fc）结合在一起，嵌合抗体可以在细胞表达系统中表达，这种抗体设计思路可以应用于中国仓鼠卵巢、Chinese Hamster Ovary - CHO、NS0、239F等哺乳动物细胞表达系统中。重组嵌合抗体有时难以表达，在Fc的选择、载体的设计和选择、宿主的选择等方面均需要综合考虑并对整个表达方案进行合理的设计。

2.1 嵌合抗体Fc的选择

重组嵌合抗体的生物学活性受直接抗原结合片段（Fragment,antigen binding，Fab）和恒定结晶片段（Fragment,crystalizable，Fc）影响。其中Fc段由于可以结合不同效应细胞上的FcR，介导抗体不同的效应功能。下表总结不同来源Fc的不同功能。

表1.2-不同来源Fc比较

2.2 载体的选择

合适的载体可以提高目的蛋白在细胞中的表达量，还可以提高蛋白的生物活性以及免疫性能。哺乳动物细胞表达系统中，所用载体可分为病毒载体与非病毒载体。采用基因工程技术制备的病毒载体可以提供更加可靠的传输途径，它们能够在细胞内实现快速、稳定的外源基因传输，这样就可以实现更加准确的遗传信息传递。然而，由于载体的体积和重量都比较紧凑，如果外源基因的体积超出了载体的承载能力，就可能使得包裹的结果不够可靠。非病毒载体具有包载量大，无免疫原性、易于大规模生产及保存等优点，其应用越来越广泛。

2.2.1病毒载体

（1）逆转录病毒与一般RNA病毒大相径庭，它们的DNA片段没有经历任何形式的自我复制，只能通过RNA片段的转录，形成cDNA，再经过DNA片段的整合，最终被植入到宿主细胞的染色质中，这样就能够把病毒的特定基因转录到细胞中，然后通过有丝分裂的方式，把这些特定的病毒的特征转移到下一个细胞中。

（2）慢病毒载体是一种基于HIV-1的改良型载体，它由1个表达质粒和多个辅助质粒组成，通过将这些质粒与293T细胞共同转染，从而形成病毒的包装，然后利用重组病毒侵入宿主细胞，使得目标基因能够以随机、稳定的方式插入，从而实现其快速、稳定的表达。

（3）腺病毒具有独特的DNA编码特性，它们可以在细胞表面与受体CAR相互作用，从而使细胞受到病毒的侵袭。它们的基因并未被完全编码，而是被分散到细胞表面，并利用细胞的转录、表达等反应来完成病毒的复制与构建。

2.2.2非病毒载体

利用哺乳动物细胞在获得重组抗体时，载体的选择主要考虑启动子、蛋白标签以及选择标记。

（1）“启动子”可以被视为RNA聚合酶与某些转录因素的关键因素，它能够调节蛋白质的表达，并且在蛋白质表达调节方面发挥着重要的作用。哺乳动物细胞表达系统中，常见的启动子有-CMV, SV40, EF1a, CAG等。SV40在蛋白表达能力上稍弱因此选择相对较少。若所用细胞为免疫细胞、干细胞等可选择具有EF1a启动子的质粒作为载体。

（2）蛋白标签的添加是通过在目标蛋白的 C末端或N末端添加一段多肽或蛋白质实现的，可以为已表达的基因提供一种特定的标记，这样可以更好地进行检测和纯化等工作。比较常用的标签有His、FLAG、HA、Myc、GFP等。

（3）通过使用不同类型的标记，可以更准确地识别出表达特定功能基因所需的细胞。这些标记包括Puromycin、Blasticidin、Neomycin、Zeocin、ZsGreen、EGFP、RFP以及mCherry，它们可以帮助我们更好地理解这些功能。

2.3 共转染原理和注意事项

转染是一种将遗传物质（如质粒）从外界环境中转移到哺乳动物细胞的过程，它可以通过瞬时转移（transient transfection）或者稳定转移的方式来实现。通过基因工程技术，可以将多个基因同时导入感受态细胞，这一过程被称为共转化（cotransformation）或共转染。在共转染的实验操作中应注意两点：1两个质粒的复制子不一样，相同的质粒复制子相同会出现不相容性；2所带的抗性最好是不一样。

2.4嵌合抗体纯化技巧

70％~80％的抗体纯化使用 Protein A/G 亲和层析法，这种技术可以将抗体精确地分离出来。Protein A 与 IgG 的结合强度很大程度上依赖于该抗体的种属和亚类，而 Protein G 对于大多数哺乳动物的 IgG 则有着更高的亲和力，因此，Protein G 可用于纯化不能与 Protein A 很好结合的哺乳动物单抗或多抗 IgG 的纯化。经过亲和层析，可从样品中得到高纯度（> 95％）的抗体。

3.重组嵌合抗体的优势

(1)降低人体抗鼠抗体（Human anti-mouse antibody，HAMA）反应;

(2)抗体的多样化选择，包括型、亚型、类与亚类、结构域和糖基化位点的添加，发挥抗体的独特功效；

(3)人源Fc 段可以显著影响生物学反应的机制和功能。

(4)由真核表达载体和人抗体恒定区组成的嵌合抗体可以容许插入不同的鼠单克隆抗体的可变区，缩短操作和研制周期;

(5)操作相对简单

卡梅德生物已建立了完善的哺乳表达体系，包括但不限于FreeStyle 293-F 细胞系、Expi 293-F细胞系、Expi-CHO-K1和Expi CHO-S等细胞系，配合卡梅德设计的高表达载体（含有全长的CMV启动子以及优化后的分泌信号肽序列），能够为客户提供更高表达水平的重组嵌合抗体的表达与制备，包括但不限于各种种属的嵌合抗体、人源化抗体、VHH、scFv、Fab等各类型的重组抗体及抗体融合蛋白。同时，卡梅德拥有全套GE提供的纯化填料和设备、规模化发酵、一次性细胞发酵工厂进行细胞培养和蛋白表达制备、可批量为客户提供高质量重组嵌合抗体，该技术平台发酵与转化一次性完成，周期大大缩短。