竞争法ELISA(也称抑制或封闭法ELISA)通过定量某种样品分析物对预计信号的干扰,来测定该分析物在样品中的含量。
抗原抗体的结合是一个可逆的反应:A+B ⇋AB(A表示抗体,B表示抗原,AB表示抗原抗体结合物)。当反应达到平衡时,解离常数Kd=[A][B]/[AB],[AB]表示反应平衡时抗原抗体结合物的浓度,[A]表示反应平衡时游离抗体的浓度,[B]表示反应平衡时游离抗原的浓度。
① 当反应体系中抗体很少,而抗原过量时,反应平衡后[AB]>[A];
② 当反应体系中抗原量很少,而抗体过量时,反应达到平衡后[AB]<[A];
③ 当反应体系中抗原抗体的量刚好合适时,反应达到平衡后处于半饱和状态,此时[AB]=[A],则Kd=[A][B]/[AB]=[B]。
在半饱和状态下,如果抗体的浓度很低,反应消耗的抗原很少,则反应后游离的抗原浓度[B]约等于总的抗原浓度[B]总,此时Kd=[B]≈[B]总。因此,只要在抗体浓度较低的情况下,找到可以在反应平衡后达到半饱和状态的抗原浓度[B]总,便可以得到解离常数。
竞争法的基本过程是选择少量的靶点分子和能够占据该靶点分子80%结合位点的标记的信号分子,加入梯度稀释的待测样品,将三者进行混合反应后检测靶点分子-信号分子复合物的信号值,绘制待测样品浓度和信号的剂量曲线,该曲线往往是反S型,得到IC50值,IC50越小,说明该待测样品和靶点分子的亲和力越强。
