1、怎么才能设计出合适的引物呢？

答：首先，我们要知道目的基因的序列，知道序列后，借助Oligo或Primer设计引物，在设计引物时，要注意引物的长度，GC含量，引物的Tm值等问题。

2、PCR产物没有条带？

答：可能的原因有多个。(1)引物的原因：引物因储存不当降解或引物设计不合理，需检查引物序列并重新合成引物，若之前实验正常，可排除这个可能；(2)模板的原因：模板长期存放、反复冻融都会导致降解；若模板DNA来源与植物，那么我们应选择非多糖多酚植物的新鲜叶片，在提取DNA或RNA时，需要借助液氮对其进行研磨，并且操作迅速；若模板为cDNA我们需对RNA进行浓度纯度和完整度测定；(3)酶：酶失活，可以使用新的酶或另一种酶进行实验；(4)反应体系：反应体系不合理；(5)反应程序：预变性、变性温度是否过高，导致酶失活；或变性温度过低，导致模板链没有打开；若排除这些原因，可能是退火温度不适合，需要设置温度梯度进行实验摸索。

3、出现非特异性扩增？

答：(1)引物的自退火导致次级发夹环结构的形成；(2)引物相互退火，而不和DNA模板结合，产生引物二聚体；(3)模板DNA被污染或模板过；(4)反应程序不够优化：若出现比目的条带大的条带，可以适当的缩短延伸的时间或循环次数；反之则延长延伸时间增加循环次数。

4、PCR产物在验证跑胶时，出现拖尾的现象？

答：(1)在制胶时，琼脂糖凝胶粉末没有完全溶解；(2)非特异扩增过多；(3)酶的用量过多；(4)若出现月牙状的条带，则说明电压高了。

5、空白对照为什么有条带？

答：(1)引物设计不合理，扩增出非目的基因片段；(2)若空白对照的条带与目的条带大小一致，说明有污染。需要更换新的buffer缓冲液、ddH2O或引物重复实验。(3)若空白对照条带的亮度比目的条带弱，可通过降低循环数使空白对照扩不出目的条带。