qPCR是在PCR技术中加入荧光染料（SYBR Green I或TaqMan探针）的一种更高效、精准的分子生物学技术，基于PCR的原理，qPCR实现了在每一轮循环后都能观察到产物的变化情况。因此，可以对PCR进程进行实时检测。

在qPCR实验中，SYBR染料法和TaqMan探针法是一个重要的组成部分，SYBR Green I和TaqMan探针都可以使PCR过程中发出荧光信号。

SYBR染料法利用SYBR Green I分子在游离时能发出微弱的绿色荧光，一旦结合到双链DNA的小沟区域就能发射出强烈荧光的特点，荧光信号会随着PCR产物的增加而增加，呈正比增长。

TaqMan探针法则是根据完整的TaqMan探针会发出荧光信号，只有在链延伸时，Taq酶发挥5’-3’外切酶活性水解探针，淬灭集团不发挥作用就可以检测到每一轮反应产物的生成情况。因此，qPCR技术不仅有PCR的快速、灵敏性，同时还拥有专一性、可实时监控、可精确重复性等优势。

qPCR的应用十分广泛，可以用于基因表达定量分析，甲基化检测分析、基因表达差异分析等，然而，qPCR的成功取决于所使用的引物。引物设计的一些考虑因素如GC 含量、引物二聚体或二级结构形成。有一个合适的引物是成功的开始，首先找到目的基因序列，然后借助软件Primer等，进行引物设计，引物的长度一般在18-30nt之间，引物的长度不宜过短，过短会导致产生非特异性扩增，太长则容易形成“发夹结构”；在设计引物时，要尽量跨内含子设计，这样可以减少非特异性扩增的可能，同时GC含量最好控制在40%-60%左右；设计好引物还要进行特异性验证，溶解曲线单峰且Tm>80℃即认为扩增特异性较好，一个好的引物扩增效率可以达到90%-110%。

qPCR就是根据每一个循环PCR扩增反应产物的实时荧光信号变化，记录PCR产物类似于指数或S形增长的模式，直到荧光达到平台水平，每个反应槽内经历了多少次循环后荧光信号达到设定的域值，这个循环数就是Ct值；Ct 值越小，反应扩增到达平台期所需循环数越少，目的基因起始含量越高，如图。

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