一．酶联免疫吸附测定（ELISA）

通过使用酶联偶联物和底物获得的颜色变化来显示抗原-抗体反应的定量分析方法，用于鉴定生物流体中分子的存在和浓度，通常成为酶联免疫吸附测定。浓度较低的分子，例如多肽/蛋白质、维生素和药物、激素，对为其开发的抗体或抗原表现出高水平的特异性。因为抗体几乎不可能与自身抗原以外的分子结合。因此，当我们知道抗原对某种物质具有特异性时，我们可以识别其抗体的类型和数量，当我们有抗体时，可以通过该方法找到其特异性抗原和抗原的数量。

二．ELISA检测方法是如何工作的？

在ELISA方法中常用刚性聚苯乙烯、聚氯乙烯和聚丙乙烯制成的管和微孔板作为固相。所使用的微孔板必须能够适当地吸附抗原和抗体，但不能吸附其他相中的成分。

可用于ELISA的酶包括半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。碱性磷酸酶可与其偶联叠氮化钠一起储存在4℃。碱性磷酸酶和P-硝基苯基磷酸被当作底物，又安全的片剂形式，在阳性反应中产生黄色。对于过氧化物偶联物，用5-氨基水杨酸和正苯二胺作为底物，产生棕色被认为是正反应。如果使用半乳糖苷酶，则必须在荧光计中读取样品。酶-底物反应通常在30-60分钟内完成，可使用氢氧化钠（NaOH）、盐酸（HCL）或硫酸（H2SO4）停止反应。根据所使用的共轭物的特性，在400-600nm的分光光度计上读取结果。

三．ELISA检测的类型

（1）直接ELISA检测：适用于测定高分子量抗原的量。在检测板表面直接包被抗体或抗原。酶标记的抗体或抗原使测量成为可能。孵育后进行洗涤，将未结合的抗原或抗体从培养基中去除。然后将适当的底物添加到培养基中，通过着色产生信号。测量信号反应了抗原或抗体的量。

（2）间接ELISA检测：之所以被称为间接法，是因为分离待测抗原的不是一抗而是放置在培养基中的另一种抗体。例如：将患病血清加入抗原包被的孔中，培养皿孵育，为了使抗原-抗体复合物可见，需要添加一种能识别血清中该抗体并被酶标记的二抗。然后将酶的底物加入培养基中产生颜色，并测定浓度。

（3）夹心ELSIA检测：将样本加入到包被抗体的微孔板中，然后将板孵育一段时间并洗涤。洗去未结合的抗原，当发现结合抗体的特异性抗原时，这些抗原就不能被去除。在洗涤步骤之后，加入带有抗原特异性酶标记的抗体并进行孵育。在孵育和洗涤之后，如果培养基中有抗原，这些抗原就不能被去除，因为酶标记的抗体与抗原结合在一起。为了揭示酶的活性，在培养基中加入酶底物，保证染色。着色表明阳性结果，而不着色表明酶缺乏或阴性结果，由于相关蛋白被夹在两个抗体分子之间，因此该方法被称为三明治夹心ELISA。夹心ELISA的敏感性是其他ELISA法的2-5倍。

（4）竞争性ELISA检测：在孔的表面涂上抗原特异性抗体或抗体特异性抗原。将待测样品和被标记的抗原或抗体同时放入孔中，标记的和未标记的抗原（患者抗原）或抗体分子相互竞争，与孔中的抗体或抗原结合。在洗净孔中加入酶底物后，所得到的着色可以定量测定浓度。分析物浓度与所得显色强度成反比。当抗原的量或血清中分析的抗体低，获得高吸光度，而大量产生低吸光度。

四．不同类型的酶联免疫吸附试验（ELISA）的优缺点

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